Types de microscopes à fluorescence

Lorsque les microscopes ont été inventés vers 1600 C.E., les philosophes naturels ont tourné leurs yeux sur un monde dans un monde. Lorsque conçu Antony van Leeuwenhoek petites lentilles très incurvés et un support mécanique pour ajuster la vue, il a ouvert une fenêtre sur le monde microscopique des bactéries, des cellules sanguines, protozoaires et la structure cellulaire des plantes. Mais tout au long de l`histoire de la microscopie, il a toujours été une question: Quelles sont ces choses étranges vus à travers une lentille? La microscopie à fluorescence se réfère à un ensemble de techniques qui minimisent cette incertitude - car en microscopie de fluorescence lorsque la lumière est projetée sur un échantillon, il brille de sa propre lumière de retour.

épifluorescence

De loin le microscope à fluorescence la plus commune est la configuration épifluorescence. Dans un microscope à épifluorescence, une source lumineuse - généralement une lampe au mercure ou au xénon - brille à travers un filtre qui sélectionne une région étroite de longueurs d`onde. La lumière filtrée brille sur l`échantillon à travers la lentille d`objectif du microscope. La lumière entrante est absorbée par fluorophores - étiquettes moléculaires qui émettent de la lumière d`une grande longueur d`onde quand ils absorbent la lumière d`une longueur d`onde plus courte. La lumière des fluorophores, ainsi que la lumière diffusée à partir de la source d`éclairage, remonte dans l`objectif et le détecteur ou les yeux. De même, un autre filtre bloque la lumière d`illumination, donc tout ce qui est à gauche est la lumière fluorescente provenant de l`échantillon.

confocale

Un microscope à épifluorescence recueille la lumière de partout dans le champ de vision du microscope. Une partie de la lumière d`excitation est absorbée avant le plan focal du microscope, certains au plan focal et un peu au-delà du plan focal. Parce que le microscope recueille toute cette lumière, l`image contiendra une image nette de la lumière au foyer, mais il aura également hors focaliser la lumière provenant d`autres régions. Un microscope confocal fixe que par focalisation d`un point laser dans le même plan que le microscope est focalisé. Ensuite, un sténopé passe devant le détecteur, où il bloque toute la lumière qui ne vient pas de la mise au point du microscope. En balayant l`échantillon, une image en trois dimensions propres de l`objet peut être obtenu.

multiphotonique

Dans un microscope confocal l`alignement est très sensible. Si la tache laser, l`objectif du microscope, l`optique collecte et le sténopé sont éteints la moindre quantité de la performance du microscope souffre. Un microscope multiphotonique contourne ce problème en utilisant une longueur d`onde laser qui est seulement la moitié aussi énergique que ce doit être pour exciter les fluorophores dans l`échantillon. La seule façon dont les fluorophores auront excité et émettre une fluorescence est si la lumière laser est assez brillant pour que deux particules de lumière - les photons - frapper le fluorophore dans un temps très court. Cela ne se produit que lorsque le laser est focalisé sur un endroit très petit. Donc, le seul endroit dans l`échantillon qui émettent de la lumière est là où le laser est focalisé, qui maintient l`image agréable et propre car il n`y a pas de lumière de fond supplémentaire pour se débarrasser de - ce qui signifie pas sténopé à aligner.

Total des Fluorescence de réflexion interne (FRBR)

Une autre façon d`obtenir des images très propres est pour vous assurer que la lumière d`excitation ne va pas très loin dans l`échantillon. Si un blob de neurones, par exemple, est placé dans une goutte de solution sur une lame de verre, puis certains des neurones adhèrent à la surface du verre. Dans un microscope de fluorescence par réflexion interne (TIRF) totale de la lumière est dirigée latéralement dans la lame de verre de sorte qu`il ne fait pas vraiment dans la solution en maintenant les cellules. Mais une partie de la lumière juste fuit à peine dans la solution - juste très proche de la surface du verre. Cela signifie que les seuls endroits qui émettent de la lumière sera dans une région très mince tout contre la surface du verre. Pour quelque chose comme les neurones, où tant des choses beaucoup plus intéressantes qui se passe sur la surface des cellules, cette technique peut être très efficace.

Super-résolution

Tous les microscopes - y compris des microscopes à fluorescence - sont limitées par la physique qui régissent la propagation de la lumière. L`une des règles de base est qu`un spot focalisé de la lumière ne peut obtenir si petit - et pas plus petit. Pour la lumière visible, cette taille est d`environ 200 nanomètres ou 200 milliardièmes de mètre. Mais molécules simples ne sont que quelques nanomètres de taille, donc il y a beaucoup de fonctionnalités intéressantes qui sont en dessous de cette limite de taille, appelée la limite de diffraction. Les scientifiques développent "super-résolution" techniques pour se faufiler dans cette limite. la microscopie à illumination structurée (SIM) et stimulée par l`appauvrissement de l`émission (STED) microscopie, par exemple, sont tous deux des méthodes de microscopie de fluorescence qui limitent la taille du spot d`émission de lumière par le rétrécissement de la taille du spot de lumière d`excitation.

Les références

• lien MicroscopeHelp.com: L`histoire du microscope
• lien Florida State University: Techniques spécialisées Microscopie --- Microscopie Fluorescence
• lien Précision appliquée: Super-Resolution Technology

A propos de l`auteur

D`abord publié en 1998, Richard Gaughan a contribué à des publications telles que "Photonics Spectra," "Le scientifique" et d`autres magazines. Il est l`auteur de "Genius accidentelle: Le monde Greatest By-Chance Découvertes." Gaughan est titulaire d`un baccalauréat ès sciences en physique de l`Université de Chicago.